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维普论文检测11月6日检测样例：

前   言：近数十年来肿瘤传统手术切除和放化疗效果往往不尽人意，使得人们逐步回归重视于传统药物治疗。现代药理学研究表明许多中药具有抗肿瘤作用，其机理一般包括促使肿瘤细胞坏死、抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞分化或凋亡、通过细胞免疫及体液免疫来消除体内的肿瘤细胞等。其中抑制细胞增殖、促进细胞凋亡是不同作用机制的抗肿瘤药物发挥疗效的共同目标之一。近年来抗癌药物发展的主要趋势之一是从天然药物中寻找高效低毒的有效成。中药紫草在我国有着悠久的用药历史，其为紫草科多年生草本植物。本文研究的紫草素(shikonin)是一种小分子萘醌类活性物，提取自紫草科植物紫草，具有广谱的生物学和药理学活性。医学实验研究表明，紫草素可以在多个层面上抑制肿瘤的发生、发展，包括抑制肿瘤细胞增殖并诱导凋亡[3]。成玲剑等[4]研究显示紫草素衍生物5，8-二甲基-2-β-羟基-异戊酰紫草素（SK36）能明显抑制人急性髓系白血病细胞株HL-60细胞的增殖，呈剂量与时间依赖性，并在显徽镜下可见典型的细胞凋亡形态学变化。

鼻咽癌(nasopharyngenl carcinoma，NPC)为我国常见的头颈部恶性肿瘤之一，发病率超过20/10万，大多数为低分化鳞癌，其发生部位隐蔽，不易被早期发现，且恶性程度高，易转移和复发，目前临床主要以高剂量的放疗联合化疗治疗为主，但毒副作用大，且易产生耐药性，因此迫切需要研究和开发高效低毒的新药。

细胞凋亡(apoptosis)是指细胞接受某种信号的刺激后, 触发自身调控程序, 主要通过一系列酶的激活级联反应而发生的“细胞自杀”过程。其特殊的形态学改变有:胞浆变圆，细胞附着消失，与邻近细胞分离，胞浆浓缩，染色质高度边集，核仁碎裂，核内出现数个空泡结构，进而胞膜内凹，分解成多个“凋亡小体”。其主要意义有：①使细胞增生和细胞死亡处于动态平衡状态，以维持细胞总数相对恒定,防止细胞癌变；②维持胚胎正常发育及免疫系统反应中的克隆选择；③参与机体防御反应的重要部分，是维持正常组织平衡的重要保护机制。细胞凋亡有着典型的细胞形态学改变并由内源性机制所调控[9]，对减少癌症的发生有重要的意义[10]。研究证实，凋亡与肿瘤的生长及发展关系密切[11]。Hickman等于1992年首次指出将诱导肿瘤细胞凋亡作为今后抗肿瘤药物的新筛选靶点，此后逐渐成为国际癌症治疗研究的主要方法和目标。在细胞凋亡的诸多调控因素中，Bcl-2蛋白家族备受瞩目，其中的Bcl-2和Bax是细胞凋亡过程中的关键调节因素，是近年来研究较多的凋亡调控基因，在适当条件下，Bcl-2与Bax两分子可彼此结合形成异二聚体或与自身结合形成二聚体，当Bax过表达时，细胞死亡增多，而Bcl-2过度表达时，它与Bax结合，死亡被抑制，因此Bcl-2与Bax的比列是决定细胞凋亡敏感性的变阻器。已有相关文献[12-15]报道，紫草素可抑制胃癌细胞、宫颈癌细胞、人恶性黑色素瘤细胞、肝癌细胞等多种肿瘤细胞增殖与诱导细胞凋亡，但目前国内外在紫草素对人鼻咽癌细胞增殖、凋亡的影响及凋亡相关机制方面的研究鲜有报道。目前国内外对紫草素诱导人鼻咽癌细胞凋亡作用的研究报道甚少，本实验研究旨在观察紫草素在体外对人鼻咽癌细胞的增殖及凋亡生物学行为的影响，初步探索紫草素治疗鼻咽癌的可能性及价值。为紫草素用于鼻咽癌的临床治疗奠定理论基础，同时也为合理开发利用中药资源提供实验数据。

本实验研究通过紫草素作用于高分化鼻咽癌细胞CNE-1、低分化鼻咽癌细胞CNE-2和人永生化鼻咽上皮细胞NP-69后，体外观察各细胞株细胞增殖抑制率、细胞凋亡形态学变化、细胞凋亡率及基因Bcl-2、Bax mRNA表达量的变化情况，探讨紫草素对鼻咽癌细胞株和NP-69的细胞增殖、凋亡的影响及相关机制研究。

2.2 方法步骤

2.2.1细胞培养

人永生化非癌性鼻咽上皮细胞株NP-69细胞接种于不含血清的keratinocyte-sfm培养液中,鼻咽癌细胞株CNE-1、CNE-2接种于含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素及100 μg/ml链霉素的RPMI1640培养液中(pH7.2)，在37 ℃、含5 %CO2 湿润空气的恒温密闭式培养箱中培养，每24～48小时换培养液，经3次传代稳定后取对数生长期细胞进行实验。

2.2.2 CCK-8试剂盒检测紫草素对鼻咽癌细胞增殖的抑制作用

取处于对数生长期的CNE-1、CNE-2和NP-69细胞接种于96孔培养板中（细胞数浓度为5×104个/ml），每孔100ul，在37 ℃、5 %CO2条件下培养12h,换液后再分别加入含不同浓度的紫草素（1 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml）的培养基100ul，每组设置4个复孔，于37 ℃、5 %CO2培养箱中继续孵育24、48、72小时，每孔加入10ul CCK-8溶液，继续培养4h后。于酶标仪OD450nm处测量各孔的吸光值（D），以对照组细胞的吸光值（D）的平均值为100%活细胞数目，即对照组细胞增殖抑制率为零。采用以下方法处理数据：细胞增殖抑制比例（%）=[D(对照)-D(实验)]/[D(对照)]×100%。

2.2.3 采用Hoechst33258荧光染色方法观察紫草素处理后的细胞凋亡特征

将处于对数生长期细胞以密度5×105个/ml接种于放有盖玻片(多聚赖氨酸包被)的6孔板内，预培养12h后换液加入含紫草素终浓度为1 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml的培养基1ml，作用24小时后，吸去培养基，PBS轻洗2次，每孔加4％多聚甲醛1ml，于4℃固定10min，从6孔板中取出玻片，吸水纸吸去多余固定液，避光条件下每个玻片滴加Hochest33258染液100ul，室温下染色10min，吸水纸吸去多余染液，荧光显微镜下观察、摄像。每个浓度设3个复孔。在荧光显微镜下观察，活细胞核呈较均一的淡蓝色荧光，坏死细胞一般不被Hoechst染色，当细胞核内出现密度较高的小颗粒团片状深蓝色荧光及其它显著核形态变化时即认为是凋亡细胞。